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96孔板法篩選抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌機理研究

  • 來源:酒旗網 http://www.ffpbooth.com 發布人:旗旗 新聞分類:行業資訊
    • 黑曲霉(Aspergillus niger)廣泛分布于土壤、空氣等自然環境中,可引起米粉、面包、蛋糕等米面制品的霉腐變質[1-2]。乳酸菌作為益生菌可通過生態位和營養物競爭、產生抗真菌肽和酸性物質等方式有效控制真菌的生長繁殖[3-4]。目前,應用乳酸菌控制食品中由霉菌引起的霉腐變質的研究已有相關報道。Varsha等[5]研究發現,Lactobacillus casei DY2和Pediococcus pentosaceus TG2等對Fusarium oxysporum KACC 42109、A. niger KACC42589和Fusarium moniliforme KACC08141等霉菌的抑菌直徑均大于10 mm,經ESI-MS和HPLC分析表明,抑菌成分主要為硬脂酸和水楊酸。Valerio等[6]從發酵面包中分離出Lactobacillus fermentum 18B和Lactobacillus brevis 18F對A. niger ITM5132抑菌率分別高達82.7%和100%,經LC-MS/MS分析發現其抑菌物質為苯乳酸。

      表1 乳酸菌菌株來源
      Table 1 The sources of lactic acid bacteria strains

      來源菌株來源菌株腌漬芥菜LactobacillusrhamnosusRH-11[12]鏡框魚腸道LactobacillusplantarumJK-18發酵大豆醬LactobacillusacidophilusCH-2鯽魚腸道LactobacillusplantarumJY-22傳統東北酸菜LactobacillusplantarumDL3[13]朝鮮泡菜LactobacillushelveticusLH-9酸豆角LactobacilluscaseiD400鯉魚腸道LactobacillussakeLY-19

      針對抗真菌性乳酸菌篩選方法主要有短瓊脂劃線法、牛津杯瓊脂擴散法、紙片法和96孔板法等[7-8]。而96孔板法對抗真菌性天然產物的篩選具有方便、快速、費用低等特點[9],饒瑜等[10]應用96孔板法對抗食品腐敗酵母的乳酸菌進行篩選,從57株乳酸菌中篩選出一株來自發酵泡菜的Weissella cibaria AT6,其發酵上清液對腐敗酵母的抑菌率可高達73.04%。Gerez等[11]通過96孔板法從不同源的91株乳酸菌中獲得一株產抗菌肽的乳酸菌Lb. fermentum CRL251,其無細胞上清液對A. niger CH 101和Fusarium graminearum CH 103的抑菌率均大于80%,其抗菌肽分子量小于10 kDa。目前,應用96孔板法對抗黑曲霉乳酸菌的篩選及抑制作用研究的相關報道較少。

      本文應用從傳統發酵食品和海產動物腸道中分離的8株乳桿菌屬的乳酸菌為出發菌株,以黑曲霉為目標菌,采用96孔板法篩選抗黑曲霉效果最好的乳酸菌菌株,并對其抑菌活性物質和對霉菌孢子的影響進行分析,為研發乳酸菌生物防腐劑控制米面制品中黑曲霉污染導致的腐敗提供理論和應用依據。

      1 材料和方法


      1.1 材料與儀器

      黑曲霉(Aspergillus niger CMCC 98003) 上海北諾生物科技有限公司;乳酸菌菌株 本實驗室前期分離獲得的已知菌株,見表1;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、MRS液體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;戊二醛 上海生工生物工程有限公司;乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸標品 Sigma公司。

      SPX-250智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;GI54DS高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司;MJ-250霉菌培養箱 上海蘇達實驗儀器有限公司;DL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京市東聯哈爾儀器制造有限公司;KA Vortex GENIUS3振蕩器 德國IKA公司;ZD-85氣浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司;I5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;安捷倫6890N氣相色譜儀 安捷倫公司;GC2010氣相色譜儀 日本島津公司;E-1045鍍金儀、S-4800掃描電鏡 日本日立公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 乳酸菌無細胞上清液(cell-free supernatant,CFS)的制備 參照Varsha等[5]方法稍加修改,將8株保藏于-20 ℃的乳酸菌以0.5%的接種量于10 mL MRS液體培養基中37 ℃培養12 h,連續培養2代至正常代謝水平。然后按2%的接種量接種于100 mL MRS培養基,置于37 ℃條件下培養24 h,其發酵液經10000×g、4 ℃離心5 min,取離心后的上清液經0.45 μm過濾膜獲得乳酸菌CFS,4 ℃保存備用。

      1.2.2 黑曲霉孢子懸液的制備 參照Kvanc等[14]方法稍加修改,向長滿黑曲霉PDA試管斜面中加入10 mL 2%吐溫80,后將其洗入50 mL錐形瓶放入搖床中振蕩1.5 h。取出后將孢子懸液倒入50 mL滅菌離心管10000×g離心10 min,將離心后的上清液倒入100 mL錐形瓶,后向離心管加入50 mL、0.05 mol/L PBS(pH7.2)洗滌1次,再去上清液后用10 mL PBS洗入50 mL滅菌的錐形瓶并振蕩10 min。用400目滅菌紗布過濾制成單孢子懸液,4 ℃保存備用。

      1.2.3 抗黑曲霉乳酸菌的篩選 參照Gerez方法[11]并稍作修改,96孔板法測定乳酸菌CFS對黑曲霉的抑制作用。取10 μL 104孢子/mL黑曲霉孢子懸液添加到含190 μL乳酸菌CFS的無菌96孔細菌培養板中,28 ℃培養48 h后應用酶標儀測定OD580 nm值,以接種孢子懸液于MRS培養基為對照組。乳酸菌CFS發酵液的抑菌率按公式(1)計算。

      抑菌率(%)=100-(ODLAB×100/ODcontrol)

      式(1)

      式中:ODLAB表示黑曲霉在乳酸菌CFS中培養48 h的OD580 nm;ODcontrol表示黑曲霉在MRS培養基中培養48 h后的OD580 nm。

      1.2.4 影響乳酸菌CFS抑制黑曲霉的因素分析 pH對菌株DL3抗黑曲霉的影響:以乳酸菌CFS為對照組,取乳酸菌CFS用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH分別調至pH2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5,按1.2.3方法進行抑菌活性測定。

      溫度對菌株DL3抗黑曲霉的影響:以乳酸菌CFS為對照組,取乳酸菌CFS分別經50、80、100和121 ℃處理30 min,同時按1.2.3方法進行抑菌活性測定。

      表2 乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌率
      Table 2 Inhibitory rates of CFS of lactic acid bacteria against A. niger

      菌株抑菌率(%)菌株抑菌率(%)LbrhamnosusRH-118055±009fLbplantarumJK-188365±012dLbacidophilusCH-27970±015gLbplantarumJY-228814±011bLbplantarumDL39228±010aLbhelveticusLH-97106±014hLbcaseiD4008228±013eLbsakeLY-198685±009c

      注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。1.2.5 有機酸的測定 乳酸、乙酸和丙酸:參照Yuan等[15]方法稍作修改,采用安捷倫6890N氣相色譜儀,色譜柱:CNW CD-ACIDWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×25 μm);FID檢測器溫度為300 ℃;進樣口溫度為280 ℃;升溫程序:初溫110 ℃,以10 ℃/min升至150 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持15 min;空氣流速300 mL/min;N2流速30 mL/min;H2流速30 mL/min;進樣量為1 μL;分流比為15∶1。在線性范圍內,用外標法峰面積進行定量。

      苯乳酸:參照Zhang等[16]方法稍作修改,移取待測樣品及標樣至帶塞玻璃管中,加入適量吡啶振蕩溶解,再加入50 μL BSTFA硅烷化試劑,置于100 ℃保持30 min,待測GC;采用島津GC2010氣相色譜儀。色譜柱:Rtx-5石英毛細柱(30 m×0.25 mm×25 μm);FID檢測器溫度為300 ℃;進樣口溫度為280 ℃;升溫程序:初溫180 ℃,保持20 min,以20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;空氣流速300 mL/min;N2流速30 mL/min;H2流速30 mL/min;進樣量1 μL;分流比為20∶1。在線性范圍內,用外標法峰面積進行定量。

      1.2.6 有機酸抑菌活性分析 根據上述有機酸測定結果,應用MRS液體培養基配制與乳酸菌CFS中相同濃度的乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸和四種混合酸分別按1.2.3方法進行抑菌活性測定,同時,以乳酸菌CFS作為對照。

      1.2.7 掃描電鏡觀察乳酸菌CFS對霉菌孢子的作用 參照Akocak方法[17]并稍作修改,分別取1.0 mL 1.0×105孢子/mL黑曲霉的孢子懸液于1.5 mL滅菌的EP管中,4 ℃條件下12000×g離心10 min,去上清液。以添加1.0 mL MRS液體培養基為對照組,添加1.0 mL的菌株DL3 CFS為實驗組,4 ℃靜置培養7 d。4 ℃條件下12000×g離心10 min,用0.1 mol/L PBS(pH7.2)洗滌孢子3次,后加入1.0 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定13 h。再用pH5.6 PBS沖洗2次以除去孢子中戊二醛,每次5 min,4 ℃條件下12000×g離心10 min,去上清液并用0.5 mL無菌水將洗滌后孢子懸浮,膠頭滴管吸取1滴于潔凈蓋玻片上,置于空氣中干燥,真空噴金并鏡檢。

      1.2.8 數據處理 所有實驗均重復測定3次,數據采用平均值±標準差表示。采用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行統計和顯著性分析,采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

      2 結果與討論


      2.1 抗黑曲霉乳酸菌的篩選

      圖1是應用96孔板法測定8株不同源乳酸菌對黑曲霉抑菌效果,從中可看出,未添加乳酸菌CFS的對照組3個孔井均被黑曲霉覆蓋,添加菌株JY-22、DL3和LY-19的CFS孔井均無渾濁現象,其余菌株的孔井均出現不同程度的渾濁現象。表2是8株乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌結果,可看出Lb. plantarum DL3抑菌效果最好,抑菌率為92.28%;Lb. sake LY-19和Lb. plantarum JY-22次之,抑菌率分別為86.85%和88.14%;其余乳酸菌菌株相對較弱,抑菌率均低于85%。因此,選取Lb. plantarum DL3進行下一步的實驗。

      圖1 乳酸菌CFS對黑曲霉的抑菌效果
      Fig.1 Antibacterial effects of CFS of lactic acid bacteria against A. niger

      2.2 影響乳酸菌CFS抑制黑曲霉因素分析

      2.2.1 pH對菌株DL3抗黑曲霉的影響 乳酸菌生長代謝過程中形成的酸性環境或產生的酸性物質對真菌均具有抑制作用[18]。因此,pH因素對菌株DL3 CFS抗黑曲霉具有重要的影響。圖2是不同pH條件下菌株DL3 CFS對黑曲霉抑制結果,從中可看出,pH2.5~4.5范圍內,抑菌率均為90%左右,抑菌活性穩定;隨著pH的升高抑菌率逐漸降低,pH5.5~6.5范圍內抑菌率下降顯著,當pH6.5時,對黑曲霉仍具有抑制作用,抑菌率為23.17%(pH7.0~7.5抑菌率為0,未給出)。結果表明,菌株DL3的抑菌活性物質在pH2.5~6.5范圍內對黑曲霉具有抑制作用,抑菌作用可能來源于酸性物質。Muhialdin等[19]研究發現,Lb. fermentum Te007和Lb. pentosus G004代謝產生的抗A. niger的抑菌活性物質在pH3.0~7.0范圍內具有抗菌活性;當pH7.0時,2株乳酸菌對A. niger的抑菌率分別為29.90%和33.50%,經HPLC分析表明抑菌活性物質為有機酸類。本文與文獻[19]的研究結果相似。

      圖2 不同pH對植物乳桿菌DL3 CFS抑制黑曲霉活性的影響
      Fig.2 Effects of pH on the antifungal activity of Lb. plantarum DL3 CFS against A. niger
      注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3同。

      2.2.2 溫度對菌株DL3抗黑曲霉的影響 溫度也是影響菌株DL3 CFS對黑曲霉抑菌活性的因素。圖3是菌株DL3 CFS經不同溫度處理30 min后對黑曲霉抑菌作用的變化,從中可看出,隨溫度的升高抑菌率呈下降趨勢,與對照組相比50、80和100 ℃處理后的菌株DL3抑菌率均無明顯變化,121 ℃處理后抑菌率僅下降了5.71%,其原因可能是乳酸菌CFS中一些熱敏感性的抑菌物質失活。如此說明菌株DL3 CFS中抑菌活性物質具有良好的熱穩定性。Muhialdin等[19]研究發現Lb. fermentum Te007和Lb. pentosus G004 CFS經90 ℃和121 ℃處理30 min對A. nigei和A. oryzae仍具有較強的抑制作用,與本文結果相似。

      圖3 熱處理植物乳桿菌DL3 CFS對抑菌活性的影響
      Fig.3 Effects of heat treatment on the antifungal activity of Lb. plantarum DL3 CFS against A. niger

      2.3 有機酸對抑菌活性的影響

      乳酸菌代謝產物中抗真菌物質主要包括有機酸、過氧化氫、羥基脂肪酸和抗菌肽等活性成分[20]。表3是菌株DL3 CFS中乙酸、乳酸、丙酸和苯乳酸含量及其對黑曲霉的抑菌結果。從中可看出,乳酸和乙酸含量相對較高分別為5.743 μg/mL和1.635 μg/mL,苯乳酸次之為0.085 μg/mL,丙酸含量較低為0.033 μg/mL。乳酸和乙酸對黑曲霉均具有較強抑制作用,抑菌率分別為91.69%和92.04%,其余兩種酸可能是由于含量較低對黑曲霉不呈現抑制效果。按照DL3 CFS中有機酸含量進行復配后的酸對黑曲霉抑菌率略高于對照組,為92.31%(p>0.05)。可以得出乙酸和乳酸為菌株DL3 CFS中抗黑曲霉的主要抑菌活性物質。

      表3 植物乳桿菌DL3 CFS有機酸及抑菌率分析結果
      Table 3 The results of Lb. plantarum DL3 CFS organic acid contents and the inhibitory rate

      有機酸含量(μg/mL)抑菌率(%)乳酸57439196±002c乙酸16359204±001b丙酸0033-苯乳酸0085-混合酸74969231±009aCK9228±009a

      注:“-”表示無抑菌效果,不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

      2.4 掃描電鏡分析乳酸菌CFS對黑曲霉孢子的影響

      圖4 植物乳桿菌DL3 CFS對黑曲霉孢子的影響
      Fig.4 Effects of Lb. plantarum DL3 CFS on the spores of A. niger
      注:A:對照組,B:DL3;A、B放大倍數均為5000×。

      圖4是黑曲霉孢子經MRS培養基(對照)和菌株DL3CFS處理7 d后的掃描電鏡觀察的結果,從中可看出,經MRS處理后黑曲霉孢子(見圖4A)結構完整,表面光滑;經菌株DL3 CFS處理的黑曲霉孢子(見圖4B)出現溶解現象,孢子內容物外泄,表面出現較深的褶皺式裂痕,孢子完整性被破壞。可能是有機酸中H+與黑曲霉孢子細胞膜上的一些分子間存在相互作用導致磷脂雙分子層被損壞孢子細胞出現崩塌現象,同時,孢子細胞內部混合物出現泄露[21-23]。結果表明,菌株DL3 CFS對黑曲霉孢子具有破壞作用。Da等[21]研究發現,青霉的孢子經2.5 mmol/L水楊酸處理5 min后,部分青霉孢子的細胞膜被損壞,孢內蛋白質泄露;未經處理的孢子細胞膜完整無損無泄露。本文與文獻[21]的研究結果相似。

      3 結論


      傳統發酵食品和海產動物腸道是拮抗性乳酸菌的主要來源,本文從8株不同源的乳酸菌中篩選到對黑曲霉具有較強抑菌作用的Lb. plantarum DL3,其抑菌率高達92.28%。通過pH和溫度處理,表明菌株DL3 CFS中抑菌活性物質在pH2.5~6.5具有抗黑曲霉活性,其抑菌物質對熱穩定。經氣相色譜儀分析菌株DL3 CFS中的抑菌活性物質主要為乳酸和乙酸,其含量分別為5.743 μg/mL和1.635 μg/mL。掃描電鏡結果表明菌株DL3 CFS對黑曲霉抑菌作用機制主要通過破壞黑曲霉孢子的完整性,從而抑制其生長和繁殖。因此,菌株DL3可作為控制黑曲霉的生物防霉劑的出發菌株,應用于米面加工制品的防霉保鮮。


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      Screening and inhibition mechanism of lactic acid bacteria againstAspergillus niger using 96-well microtiter plates

      MA Huan-huan1,LIN Yang1,LV Xin-ran2,SUN Meng-tong1,BAI Feng-ling1,*,LI Jian-rong1,SONG Qiang3

      (1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China; 3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)


      Abstract:Objective:To isolate lactic acid bacteria(LAB)with outstanding inhibitory activity againstAspergillus niger. Methods:LAB with inhibitory activity against A. niger was screened using 96-well microtiter plates.Research on effect factors of antibacterial was analyzed by pH test,heat-treated test. Research on the antimicrobial substances of the contents of organic acids were analyzed by the gas chromatography. Research on the antibacterial mechanism of the integrity of cellular of spores was observed by scanning electron microscope. Results:Lactobacillus plantarum DL3 isolated from traditional northeast Suancai had strong anti-fungal activity against A. niger,and its inhibitory rate reached 92.28%. Antimicrobial substances were effective within pH2.5~6.5 and heat stable,which was declined by 5.71% after incubation at 121 ℃ for 30 min. The contents of lactic acid,acetic acid,propionic acid and phenyl lactic acid in CFS of strain DL3 were 5.743,1.635,0.033 and 0.085 μg/mL using gas chromatography analysis,respectively. In addition,the inhibition rate of lactic acid and acetic acid to A. niger were 91.69% and 92.04%,respectively. Therefore,antimicrobial substances produced by strain DL3 were preliminary determined as organic acids. The propionic acid and phenyl lactic had no inhibition against A. niger. The scanning electron microscope images revealed that the membrane of the spores of A. niger treated with CFS of strain DL3 was damaged and dissolved,resulting in the leakage of intracellular material from spores. Conclusion:Lactic acid and acetic acid were the main inhibitory substances produced by strain DL3,which could be used as starting strain of biological fungicide in rice and flour products.


      Key words:lactic acid bacteria;inhibition;Aspergillus niger;96-well microtiter plates;screening;organic acid


      收稿日期:2016-11-30


      作者簡介:馬歡歡(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品安全與質量控制,E-mail:mahuanhuan14@163.com。

      *通訊作者:白鳳翎(1964-)男,博士,教授,研究方向:食品安全與質量控制和食品微生物學,E-mail:baifling@163.com。


      基金項目:遼寧省科技廳攻關項目(2015103020);泰山學者藍色產業領軍人才團隊支撐計劃項目(魯政辦字(2015)19號)。


      中圖分類號:TS201.1


      文獻標識碼::A


      文章編號::1002-0306(2017)12-0171-05


      doi:10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.031
      文章地址:http://www.ffpbooth.com/news/1120.html

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